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Princípios Fotobiológicos de Aplicações Terapêuticas da Radiação Laser



Yu. A. Vladimirov, A. N. Osipov, and G. I. Klebanov


Resumo


A terapia a laser baseada na ação estimulante e cicatrizante da luz de lasers de baixa intensidade (LIL), juntamente com a cirurgia a laser e a terapia fotodinâmica, tem sido ultimamente amplamente aplicada na irradiação de tecidos humanos na ausência de fotossensibilizadores exógenos. Além do LIL, são utilizados diodos emissores de luz na fototerapia (fotobioestimulação) cuja ação, como a do LIL, depende do comprimento de onda da radiação, da dose e da distribuição da intensidade da luz no tempo, mas, segundo todos os dados disponíveis, não depende da coerência da radiação.


A ação da luz visível nas células especializadas do olho é a base da visão. No entanto, o problema da possibilidade de ação da luz visível sobre outras células e tecidos humanos e animais permaneceu por muito tempo inexplorado.

O aparecimento dos lasers, fontes de intensa radiação visível e infravermelha, deu um novo impulso a este problema. Os lasers tornaram-se amplamente utilizados em cirurgia e terapia, e a questão de saber se a luz visível tem algum efeito foi resolvida por si só. O mecanismo de ação da luz laser pode, no entanto, variar em diferentes situações e na sua maioria é pouco estudado.

A ativação de processos vitais sob radiação laser, muitas vezes chamada de bioestimulação, é de maior interesse.

Sob grandes doses de radiação laser, sua ação positiva se transforma, via de regra, em inibição dos processos de atividade vital, o que é o principal obstáculo ao sucesso da aplicação da terapia a laser e causa de decepção.

No entanto, a radiação por lasers de baixa intensidade (LIL) e diodos emissores de luz (LED) é amplamente utilizada por fisioterapeutas e dentistas (para reduzir a dor), dermatologistas (tratamento de edema, eczema e dermatite), cirurgiões (tratamento de úlceras, queimaduras, diabético pé), reumatologistas (seja para aliviar dores ou tratar doenças crônicas, artrite e artrose), terapeutas, em medicina veterinária, medicina esportiva e centros de reabilitação. Segundo dados do Medline (pesquisa pelas palavras-chave laser e terapia), 1700 a 2400 artigos sobre aplicação terapêutica de lasers têm sido publicados anualmente durante os últimos dez anos, e esse número cresce continuamente.

A exposição a lasers e também à luz LED é atualmente aplicada na terapia. A irradiação mais eficaz é aquela na faixa vermelha e infravermelha próxima do espectro. As fontes mais utilizadas são o laser de hélio-neon (He-Ne) (radiação a 632,8 nm), o laser de gálio-alumínio (Ga-Al) (630-685 nm), o laser de hélio-neon-arseniato (He- Ne-As) (780-870 nm) e o laser de arseniato de gálio (Ga-As) (904 nm), bem como diodos emissores de luz cuja banda de emissão se encontra em uma ampla região do espectro (670 a 950 nm). A principal razão para a utilização de fontes que irradiam na região espectral do vermelho e do infravermelho próximo é que a hemoglobina não é absorvida nesta região e a luz pode penetrar profundamente nos tecidos vivos.

A comparação dos efeitos terapêuticos de uma fonte coerente (LIL) e uma fonte incoerente (LED) não mostrou diferença significativa. Isto também é relevante para a ação da luz no nível das células, onde fontes coerentes e incoerentes tiveram o mesmo efeito nos mesmos comprimentos de onda, intensidades e tempos de radiação.


AÇÃO DA LUZ VISÍVEL NAS CÉLULAS E TECIDOS ANIMAIS


O que se sabe sobre a ação da radiação laser em objetos mais simples do que um ser humano doente? Considere alguns fatos bem estabelecidos.

A radiação com comprimento de onda de 400 a 500 nm e cerca de 600 nm acelerou a divisão celular em vários microrganismos e aumentou a síntese de proteínas.

Por exemplo, a radiação de dois tipos de fibroblastos com um laser He-Ne durante 15 min (1 W/m2) acelerou o crescimento da população na fase exponencial e a fixação das células ao substrato. A radiação de células L com laser He-Ne resultou em um aumento do índice mitótico no 3º e 4º dia após a irradiação. Um aumento pequeno, mas confiável, do índice mitótico também foi observado após uma única radiação de células do epitélio da retina com laser He-Ne (83 W/m2, por 10 min). Geralmente, observa-se uma relação extrema expressa entre a ação estimulante da radiação laser e a dose. O intervalo das intensidades dentro das quais um efeito positivo foi observado foi de 1,5 a 2 ordens de grandeza. Por exemplo, foi observada uma estimulação de crescimento quase duas vezes maior na radiação de Escherichia coli com um laser infravermelho a 890 nm a uma dose de radiação de 0,7 J/m2, e a inibição do crescimento ocorreu a uma dose superior a 2,5 J/m2. A radiação de mitocôndrias hepáticas isoladas com um laser He-Ne provocou um metabolismo melhorado de ATP-ADP, um aumento no conteúdo de ATP, um crescimento do potencial elétrico através das membranas internas e do pH na matriz, bem como pequenas alterações na configuração matriz.

Alterações morfológicas evidentes nas mitocôndrias dos linfócitos foram observadas após a radiação dessas células com laser He-Ne.

A radiação com laser He-Ne geralmente não provoca a transformação blástica de linfócitos isolados, mas aumenta significativamente a transformação blástica provocada pela fitohemaglutinina (PHA) e também leva a um aumento do índice mitótico no 3º e 4º dia após a radiação com doses baixas. A ação da radiação He-Ne provoca aumento do conteúdo de cálcio intracelular nos leucócitos, aumento da coloração dos ácidos nucleicos das células pelo corante fluorescente laranja de acridina e alterações na estrutura morfológica da cromatina. A ação da radiação laser na dose ideal foi semelhante em todos os parâmetros à ação do PHA (os dados e a bibliografia são apresentados na revisão).

A radiação laser também teve efeito nas células fagocitárias tanto in vivo quanto in vitro. A seguir consideraremos os dados obtidos em nosso laboratório. Na radiação do sangue imediatamente nos vasos sanguíneos, foi observada vasodilatação acima e abaixo do local da radiação, desaparecendo o efeito na substituição do sangue por solução salina fisiológica perfundida. O efeito da vasodilatação resulta na melhora da microcirculação e do suprimento sanguíneo nos órgãos.

Assim, os efeitos observados na clínica da ação anti-inflamatória da radiação laser, da regeneração acelerada dos tecidos lesados e da melhora da circulação sanguínea nos órgãos podem ser associados aos efeitos dos lasers obtidos em experimentos: 1) crescimento da atividade de determinados células como leucócitos e fagócitos, bem como aumento do conteúdo de íons cálcio no citoplasma dessas células; 2) aumento da divisão e crescimento celular; 3) ativação da síntese de proteínas e citocinas, e 4) melhora da circulação sanguínea na corrente sanguínea devido ao relaxamento das paredes dos vasos (vasodilatação).


PRIMEIRAS HIPÓTESES DOS MECANISMOS DE AÇÃO DA RADIAÇÃO LASER


Existem inúmeras hipóteses sobre possíveis mecanismos de radiação laser. Eles podem ser divididos em duas categorias.

1. Hipóteses baseadas na ideia de uma ação específica da radiação coerente (laser) sobre os tecidos humanos e animais, as estruturas biológicas como um todo, a estrutura da água, etc.

2. Hipóteses da ação fotoquímica da luz, incluindo a radiação de lasers, LEDs e outras fontes de luz visível e infravermelha próxima. Karu observou as seguintes hipóteses relativas ao mecanismo de ação da radiação laser.


Primeiro, esta é a hipótese do oxigênio singleto (1981), segundo a qual [25] as moléculas que absorvem luz, como porfirinas e flavoproteínas, podem ser transformadas, por exemplo, na cadeia respiratória das mitocôndrias em derivados que possuem propriedades de fotossensibilizadores. Sob a ação da luz, esses compostos liberam oxigênio singlete que pode estimular, por sua vez, processos como a síntese de RNA e DNA. Os autores da hipótese encontraram corroboração desta ideia no fato de que os espectros de ativação da síntese desses compostos em culturas de células HeLa continham picos que poderiam ser atribuídos a compostos de porfirinas e flavinas. A possibilidade de formação de oxigênio singlete sob radiação também é considerada no artigo.

Em segundo lugar, a hipótese da ação da luz laser nas propriedades de redução da oxidação dos transportadores de elétrons sugerida em 1988. A excitação no complexo citocromo-oxidase de cromóforos como CuA, CuB ou hemes a (a3) influencia o estado de oxidação-redução desses centros e, consequentemente, a taxa de transferência de elétrons na molécula.


A HIPÓTESE DE TRÊS MECANISMOS DE AÇÃO DA RADIAÇÃO LASER


Em 1994, com base na análise de dados da literatura disponíveis na época e em nossos próprios experimentos, um de nós formulou a hipótese de três mecanismos de ação da radiação laser de baixa intensidade nas células humanas e no corpo humano, de acordo com para o qual a ação biológica da radiação laser na região visível da luz e sua aplicação clínica baseia-se em três reações: 1) ação fotodinâmica sobre membranas, acompanhada de aumento de cálcio intracelular e estimulação celular; 2) fotorreativação da superóxido dismutase de Cu-Zn; e 3) fotólise dos complexos metálicos do NO com liberação desse vasodilatador. Foi postulado que esses três efeitos estão subjacentes à ação bactericida, regenerativa e vasodilatadora indireta da radiação laser. Os dados experimentais que corroboram esta hipótese são apresentados a seguir.


CICATRIZAÇÃO ACELERADA DE FERIDAS COM IRRADIAÇÃO A LASER


O fenômeno da fotorreativação da superóxido dismutase celular (Cu-Zn-SOD) foi descoberto a partir da análise dos dados obtidos em estudos da ação do laser He-Ne na cicatrização de feridas. Como já foi dito, observa-se uma ação positiva da radiação laser quando utilizada no tratamento de feridas persistentes e úlceras tróficas; em particular, a radiação de feridas com laser He-Ne resultaram na cicatrização acelerada de feridas em crianças. Provavelmente, esteja parcialmente associado à intensificação da proteção antirradicalar na área da ferida. Isto pode ser avaliado a partir de experiências que demonstram alterações nas intensidades de quimioluminescência dos exsudados da ferida na presença de peróxido de hidrogênio adicionado. A luminescência foi associada à formação do radical superóxido no processo de decomposição do peróxido de hidrogênio pelo exsudato: a adição ao exsudato de superóxido dismutase (SOD) removendo radicais superóxido, bem como a adição de catalase removendo peróxido de hidrogênio, suprimiu o flash de quimiluminescência.

A radiação do exsudado com um laser He-Ne também suprimiu a luminescência, a luz do laser agindo assim como catalase e superóxido dismutase. Seria natural sugerir que a atividade da catalase e superóxido dismutase no exsudato foi inicialmente reduzida sob algumas condições e a radiação laser reativou uma dessas enzimas. Deve-se notar que ambas as enzimas absorvem o comprimento de onda da luz laser He-Ne de 633 nm.


FOTORREATIVAÇÃO DE Cu-Zn SOD SOB A AÇÃO DO LASER He-Ne


Foi demonstrado em experimentos com eritrócitos isolados Cu-Zn-SOD que uma diminuição do pH da solução e do peróxido de hidrogênio inativaram a enzima, enquanto sua reativação completa foi observada sob subsequente irradiação da enzima inativada em pH 5,9 com luz laser He-Ne. Provavelmente tal fenômeno pode ser observado em organismos vivos. Se a acidez do meio diminuir em um local do corpo humano (o que é típico de focos de funções vitais prejudicadas das células), pode-se esperar que a atividade da SOD no local diminua devido ao baixo pH.

Para elucidar o mecanismo de inativação e fotorreativação da SOD em meio ácido, os espectros de absorção e os sinais EPR da enzima foram investigados em sua inativação ácida e após irradiação com laser. Todos esses dados sugerem que a protonação do resíduo de histidina no centro ativo da enzima está subjacente à inativação de Cu-Zn-SOD, e a radiação provoca a desprotonação da histidina e a formação da ligação> NZn para restaurar a estrutura do centro ativo e a atividade da enzima (ver esquema).



Simultaneamente, outras propriedades da enzima ativa são restauradas em seu espectro de absorção e espectro EPR.

A desprotonação sob a ação da luz não é uma propriedade especial da histidina no centro ativo do Cu-Zn-SOD. A constante de dissociação de muitos cromóforos, incluindo aminoácidos aromáticos, aumenta quando a molécula fica excitada eletronicamente. Pode-se considerar que o valor pK do complexo Cu-His está acima de 5,9 no estado eletrônico excitado; assim, este complexo será desprotonado sob intensa radiação.


POSSÍVEIS CONSEQUÊNCIAS BIOLÓGICAS DA INATIVAÇÃO E REATIVAÇÃO DE SOD


A superóxido dismutase reduz a concentração do radical superóxido O2 catalisando a reação de dismutação: O2 + O2 -> O2 + H2O2.

Como resultado, a concentração de superóxido estacionário diminui nas células e tecidos onde este radical se forma constantemente, especialmente sob condições patológicas. A Figura 1 mostra um esquema que demonstra o metabolismo do radical superóxido que demonstra porque o excesso de radical pode ser tóxico para células e tecidos.

Duas reações parecem estar subjacentes à ação patogênica do O2: formação de íons de ferro ferroso (a partir dos férricos) e ligação do óxido nítrico. A ação protetora da SOD se deve à diminuição da concentração dos radicais superóxido O2 no meio em decorrência de sua dismutação (com posterior remoção do peróxido de hidrogênio nas reações catalisadas pela catalase e glutationa peroxidase.

A primeira causa da ação patogênica do excesso de superóxido é a liberação de ferro ferroso livre em diferentes depósitos. O ferro férrico livre está aparentemente ausente nos tecidos, mas está presente nas células na forma de ferritina. Penetrando na ferritina, o O2 reduz o ferro férrico a um íon ferroso livre. Os íons Fe2+ participam de pelo menos três reações acompanhadas pela formação de novos radicais livres: a reação com peróxido de hidrogênio, reação com hipoclorito e reação com hidroperóxidos lipídicos. A reação de Fenton resulta na formação do radical hidroxila, o qual é altamente reativo. Sua interação com proteínas provoca sua desnaturação, e suas reações com ácidos nucleicos são acompanhadas por efeitos mutagênicos e letais. Foi demonstrado nas investigações de A. N. Osipov e colegas de trabalho realizados com o método de spin traps que o radical hidroxila também é formado quando o Fe2+ interage com o hipoclorito e aparentemente com um rendimento maior em comparação com a reação do Fe2+ com H2O2. As reações ocorrem principalmente na fase aquosa de células e tecidos vivos onde o peróxido de hidrogênio e o hipoclorito são dissolvidos. Os íons Fe2+ na fase lipídica das membranas biológicas e das lipoproteínas atuam como potentes catalisadores (melhor dizendo, cofatores) da oxidação da cadeia de radicais livres lipídicos. Sua ação pró-oxidante é baseada na reação de ramificação da cadeia de oxidação na interação do Fe2+ com hidroperóxidos de ácidos graxos insaturados.


A totalidade das reações está subjacente a uma ação citotóxica e mutagênica mediada pelo radical superóxido O2.

A segunda causa da ação prejudicial do excesso do radical superóxido é a interação do radical com o óxido nítrico NO. Muitas células como, por exemplo, células endoteliais, neutrófilos sanguíneos e macrófagos teciduais conseguem liberar simultaneamente radicais superóxidos e produzir óxido nítrico. Enquanto isso, o superóxido e o NO interagem ativamente entre si para formar o ânion peroxinitrito com a subsequente formação do radical hidroxila. O peroxinitrito tem um efeito citotóxico extremamente potente. Removendo um dos componentes da reação de formação de peroxinitrito, a SOD protege os tecidos contra danos e evita a destruição do fator de relaxamento, reduzindo assim os danos celulares em muitos estados patológicos. A revisão dá exemplos da ação benéfica da SOD. Como exemplo podemos citar a diminuição da formação de radicais e do dano miocárdico na isquemiareperfusão cardíaca. Danos ao coração e ao cérebro devido à deficiência de oxigênio em certas áreas dos seus tecidos são uma das principais causas de morte humana nos países desenvolvidos. Pode parecer que a restauração da circulação sanguínea deve diminuir ou prevenir danos às células e tecidos que sofrem de deficiência de oxigênio.

No entanto, McCord e colaboradores demonstraram já na década de 1980 que a reperfusão pode causar danos adicionais aos tecidos (danos de reoxigenação) que, em grande medida, se devem à formação adicional de formas ativas de oxigênio, em particular, superóxido. Assim, na reperfusão de um coração que se encontra há algum tempo em estado de isquemia (ausência de circulação sanguínea), ocorre um agravamento abrupto do estado do órgão, que se manifesta principalmente por fibrilação. A introdução de superóxido dismutase no líquido de perfusão reduz significativamente este efeito; assim, pode-se concluir que são os radicais livres os principais responsáveis pelos danos da reoxigenação ao tecido.

Foi demonstrado nos trabalhos de V. A. Monich e colaboradores que se a irradiação da região do coração em animais de laboratório com luz intensa for realizada em vez da injeção de SOD, o dano cardíaco de reperfusão e a fibrilação serão removidos. Simultaneamente, a formação de produtos de peroxidação lipídica nos tecidos é reduzida ao nível de tecido intacto. Os autores explicaram esses efeitos pelo fenômeno da reativação da SOD sob a ação da luz.


AÇÃO FOTODINÂMICA DE SENSIBILIZADORES ENDÓGENOS


Se uma pequena quantidade de sensibilizador, por exemplo, hematoporfirina ou ftalocianina, for adicionada aos fosfolipídios, a oxidação lipídica ocorre sob a ação da luz (efeito fotodinâmico) e ocorre a formação de peróxido (fotoperoxidação). Como é sabido, os sensibilizantes naturais, em primeiro lugar, a hematoporfirina e seus derivados acumulam-se nas membranas celulares em certas doenças. A ação da peroxidação lipídica na camada fosfolipídica das membranas é bem investigada e apresenta vários efeitos principais: a permeabilidade aos íons H+ e/ou OH aumenta seletivamente; a permeabilidade aos íons Ca2+ aumenta; a estabilidade elétrica diminui, o que pode provocar uma autoquebra das membranas pelo seu próprio potencial elétrico. Nas membranas celulares, isso se soma à oxidação dos grupos SH e aos danos à bomba de cálcio (Ca2+-ATPase) que se torna um canal para os íons Ca2+. Além disso, os íons cálcio passam a vazar ao longo do canal formado, em vez de bombearem na direção de sua concentração mais baixa, para o hialoplasma. Um dos principais resultados de todos esses efeitos é o aumento da concentração intracelular de Ca2+. De fato, observa-se um teor aumentado de cálcio intracelular sob irradiação de células como linfócitos e granulócitos com luz laser He-Ne, resultando, por sua vez, na ativação e/ou proliferação celular.

Pode-se supor que a sequência de eventos sob irradiação laser neste caso e em muitos outros casos se parece com: 1) absorção de um fóton por um fotossensibilizador endógeno

seguida de peroxidação lipídica (fotoperoxidação); 2) entrada de íons de cálcio nas células; 3) ativação de processos intracelulares.

As consequências biológicas do aumento da concentração de Ca2+ no citoplasma serão diferentes dependendo do tipo de células expostas à radiação laser. Por exemplo, na irradiação sanguínea, é significativa a ação da radiação sobre os leucócitos (neutrófilos e monócitos) protegendo o organismo contra micróbios e participando na regulação da circulação sanguínea. 

Foi demonstrado que os produtos da peroxidação lipídica e as lipoproteínas oxidadas do plasma sanguíneo induzem a pré-estimulação (priming) das células fagocitárias, ou seja, um aumento de duas ou três vezes na sua geração de espécies ativas de oxigênio em 

resposta a um estímulo como membranas celulares bacterianas, lectinas (por exemplo, fitohemaglutinina), antibióticos, transportadores de cálcio e algumas outras substâncias. A essência do fenômeno da pré-estimulação (priming) é considerada em nossas publicações e consiste nas seguintes etapas. Inicialmente, uma célula fagocitária possui em sua superfície uma série de receptores de estímulo sob cuja ação a célula é ativada, o que é acompanhado pela geração de espécies ativas de oxigênio e quimiluminescência na presença de luminol.


Se a célula for pré-incubada com um composto que aumenta a quantidade de íon cálcio no citoplasma, o número de receptores na superfície celular aumenta, por exemplo, isso é observado quando os neutrófilos são incubados com produtos de peroxidação lipídica. Agora, a adição de um estímulo resulta em uma resposta de quimioluminescência (CL) maior do que a dos leucócitos intactos. O efeito da radiação laser He-Ne na preparação de leucócitos isolados do sangue de pessoas saudáveis e pacientes com bronquite foi investigado. Uma diferença significativa foi observada nos efeitos da radiação laser nos fagócitos sanguíneos em diferentes grupos de pacientes. No primeiro grupo, a radiação laser não afetou os leucócitos, uma vez que as células desses pacientes aparentemente não continham sensibilizador endógeno. A radiação das células por luz laser na presença de sensibilizador de ftalocianina adicionado a 10 nM resultou num efeito significativo de pré-estimulação a baixas doses de radiação. No segundo grupo, foi demonstrada uma pequena pré-estimulação na ausência de um sensibilizador exógeno, embora o efeito fosse maior e observado em doses mais baixas se um sensibilizador fosse adicionado. No terceiro grupo, o efeito da pré-estimulação foi significativo na ausência de sensibilizadores exógenos e enfraqueceu na sua presença. A conclusão geral é que os leucócitos do sangue de diferentes pacientes variaram apenas no conteúdo inicial do sensibilizador endógeno; em outros aspectos, a ação do laser He-Ne foi semelhante: o priming foi observado em baixas doses e a supressão da reatividade celular foi observada em altas doses (isto é, resposta do CL à introdução do estímulo).

Experimentos subsequentes mostraram que o efeito da irradiação dependia da quantidade de hematoporfirina no plasma sanguíneo dos pacientes: quanto maior a quantidade de porfirina, menor era a dose de radiação laser na qual o efeito do priming foi observado.

Isso é visto na figura 2, que mostra as relações entre as doses de irradiação e as respostas CL de leucócitos incubados na presença de 10 µl de plasma sanguíneo de pacientes com doenças broncopulmonares. Observa-se que quanto maior a quantidade de porfirina em 10 µl de plasma, menor é a dose de radiação na qual a resposta CL das células aumenta. Portanto, a hematoporfirina é o fotossensibilizador natural mais provável da luz laser.


ATIVAÇÃO DA SÍNTESE PROTEÍNA


Uma consequência biológica imediata da pré-estimulação de leucócitos (granulócitos e monócitos) pela irradiação sanguínea com laser é a ativação da fagocitose, ou seja, a destruição de bactérias e fungos por essas células. Este efeito direto e, portanto, de curto prazo da irradiação laser é significativamente complementado por outras consequências associadas à ativação de processos biossintéticos em células irradiadas. Foi demonstrado que a irradiação de células com laser foi capaz de induzir a síntese de diversas proteínas. Por exemplo, descobriu-se que a atividade da superóxido dismutase foi aumentada após a irradiação de leucócitos com laser, sendo esse efeito suprimido pelo inibidor da síntese protéica cicloheximida. A indução da síntese de outra proteína, a NO-sintase induzível, pela luz laser também foi de grande interesse. Foi demonstrado que após a irradiação os macrófagos peritoneais começaram a sintetizar NO, que foi detectado como produção de NO2 . A cicloheximida também suprimiu esse efeito.

Portanto, uma ação benéfica da irradiação laser é o resultado do início de reações primárias de radicais livres que induzem a ativação de células (leucócitos, fibroblastos, queratinócitos, etc.) que se expressa no aumento da atividade bactericida, produção de proteínas e citocinas e aumento da proliferação da atividade celular. Todas essas atividades são a base da ação terapêutica da laserterapia.


FOTÓLISE DE COMPLEXOS NITROSYL DE PROTEÍNAS HEME


A seguir consideramos a terceira hipótese do possível mecanismo de ação da radiação laser de baixa intensidade fotólise de complexos nitrosila de proteínas heme.

Logo após a formulação da hipótese, demonstramos a fotossensibilidade dos complexos de NO com hemoglobina e citocromo c. Foram utilizados métodos EPR e espectrofotométricos. Foi demonstrado que o sinal EPR da hemoglobina NO diminuiu sob a ação da radiação laser sobre a hemoglobina NO. Simultaneamente, o óxido nítrico é liberado, como pode ser avaliado pelo aumento do sinal EPR do aduto de spin do NO. Aparentemente, a decomposição de complexos paramagnéticos provoca o aparecimento de NO livre, de acordo com a seguinte reação: hn + HbNO -> Hb(Fe2+) + NO.


O espectro EPR do complexo citocromo c (Fe2 +) NO é uma linha assimétrica singlete com fator g de 2,00 e meia largura de ~ 100 G (Fig. 4a). Sob a ação da luz laser, a amplitude do sinal EPR diminui, sendo mais rápida quanto maior a potência de irradiação.

Conforme mostrado por experimentos com o uso de spin traps (Fig. 4b), também ocorre a liberação de óxido nítrico. Assim, na irradiação de complexos nitrosil do citocromo c (cyt c), ocorre fotólise do complexo com liberação de NO livre:

hn + cyt c- NÃO -> cyt c + NO*


ATIVAÇÃO DE TRANSFERÊNCIA DE ELETRÔNICOS EM MITOCÔNDRIAS SOB IRRADIAÇÃO LASER


A irradiação de mitocôndrias hepáticas isoladas com luz laser He-Ne resultou em aumento no conteúdo de ATP, potencial transmembrana e DpH e alterações na ultraestrutura das organelas. Todas essas observações sugerem a melhora do funcionamento da cadeia respiratória.

Um nível aumentado de ATP nas células foi observado também após irradiação de linfócitos do sangue humano com a luz de um laser infravermelho (diodo) no comprimento de onda de radiação de 820 nm. Essas alterações nas mitocôndrias indicam a preparação da célula para a divisão, embora não esteja claro se elas precedem outras alterações nas células causadas pela radiação laser ou as seguem.


POSSÍVEL PAPEL DA FOTÓLISE DE NÃO COMPLEXOS COM CITOCROMO OXIDASE


Investigações de espectros de ação de lasers e diodos emissores de luz realizadas por T. Karu e colaboradores demonstram a participação da citocromo oxidase na ação estimulante da luz na faixa vermelha e infravermelha próxima do espectro [2, 28, 53].

A Figura 5 demonstra os espectros de absorção das culturas de células HeLa (linha pontilhada) em comparação com os espectros de ação da síntese de RNA (pontos). Os espectros de ação da ativação da síntese de RNA e DNA em células HeLa e adesão das membranas plasmáticas dessas células na fase de crescimento exponencial apresentam quatro picos expressos em 630 a 657, 685 a 694, 752 a 774 e 815 a 823nm. Três deles correspondem aos máximos do espectro de absorção da célula (616, 676 e 809 nm) e são atribuídos à absorção dos complexos contendo metal da citocromo oxidase em eucariotos e, correspondentemente, ao complexo de citocromos b-d em bactérias.

Em nossa opinião, as diferenças nos espectros podem ser explicadas pelo fato de que nenhum carreador de elétrons participa do efeito fotobiológico no nível da citocromo oxidase, mas apenas seus complexos com o NO, enquanto a luz é absorvida pelos próprios carreadores. Com base em todos os dados, pode-se apresentar o seguinte esquema relativo à ação da radiação laser nas mitocôndrias ou mesmo em células inteiras.


A respiração mitocondrial na ausência de luz é parcialmente suprimida pelo óxido nítrico sintetizado pela NO-sintase mitocondrial. O óxido nítrico inibe a respiração devido à ligação com transportadores de elétrons como citocromos e citocromo oxidase e, possivelmente, complexos de ferroenxofre. A irradiação por luz intensa provoca a fotólise desses complexos e a restauração da respiração e da síntese de ATP.

Portanto, uma ação benéfica da luz laser de baixa intensidade, bem como da luz de outras fontes, por exemplo, diodos emissores de luz, baseia-se em diferentes reações fotoquímicas primárias, três delas podem ser consideradas comprovadas: 1) fotorreativação de Superóxido de Cu-Zn dismutase inativada em pH baixo em focos hipóxicos; 2) a ação fotodinâmica dos sensibilizadores endógenos, principalmente a hematoporfirina, cujo conteúdo nos tecidos é sensível em pessoas saudáveis e pode ser aumentado na patologia; e 3) a fotólise de complexos de proteínas contendo metais com óxido nítrico que provoca a liberação de NO livre e a reativação de transportadores respiratórios.

Como a radiação laser em baixas doses tem um efeito estimulante nas células, e em altas doses um efeito prejudicial, é necessário um conhecimento das condições do curso dessas reações em cada paciente individual (por exemplo, o conteúdo de porfirinas no tecido) para dosagem correta e aplicação eficaz de fototerapia.


Figuras:



Figura 1. Possíveis mecanismos de ação citotóxica do radical superóxido. Veja o texto para explicações.




Figura 2. Relação entre a resposta de quimiluminescência de leucócitos incubados na presença de 10 µl de plasma sanguíneo de pacientes com doenças broncopulmonares e uma dose de radiação com laser He-Ne: 1) controle; 2) 4,1 pmol porfirina em 10 µl de plasma sanguíneo; 3) 8,5 pmol de porfirina em 10 µl de plasma sanguíneo.




Figura 3. Esquema demonstrando relações entre os mecanismos primários e secundários de ação da radiação laser.



Figura 4. Ação da irradiação na intensidade do sinal EPR dos complexos nitrosil do citocromo c (a) e formação de NO livre contra dose de radiação com laser He-Cd (b): 1) controle; 2) radiação 8 kJ/m2.




Figura: 5. Espectro de ação da radiação laser He-Ne na irradiação de mitocôndrias (resultados obtidos no trabalho de Karu).

Os números próximos às curvas designam comprimentos de onda.



Figura 6. Esquema demonstrativo da ação do óxido nítrico e da radiação laser no funcionamento da cadeia mitocondrial de transferência de elétrons.


Leia o artigo completo no Biochemistry (Moscow), Vol. 69, No. 1, 2004, pp. 81-90.


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