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Fibroblastos e o papel nas úlceras crônicas



Ivan B. Wall, Ryan Moseley, Duncan M. Baird, David Kipling, Peter Giles, Iraj Laffafian, Patricia E. Price, David W. Thomas e Phil Stephens


Distúrbios degenerativos crônicos relacionados à idade, incluindo a formação de feridas crônicas nas pernas, podem ocorrer devido ao envelhecimento dos tecidos do estroma e às respostas celulares disfuncionais resultantes. Este estudo investigou o impacto do envelhecimento celular causado pelo ambiente na cicatrização de feridas, conduzindo uma análise abrangente do comportamento de fibroblastos de feridas crônicas (CWF) em comparação com fibroblastos normais (NF) de pele saudável correspondentes ao paciente. As capacidades disfuncionais de cicatrização de feridas do CWF correlacionaram-se com uma expectativa de vida proliferativa significativamente reduzida e início precoce da senescência em comparação com o NF. No entanto, comparações pareadas da dinâmica dos telômeros entre NF e CWF indicaram que a indução de senescência no CWF era independente dos telômeros. Microarranjos e análises funcionais sugeriram que os CWFs têm uma capacidade diminuída de resistir ao estresse oxidativo, o que pode explicar por que essas células senescências prematuramente. A análise de microarranjos revelou níveis de expressão mais baixos de vários genes de quimiocinas CXC (CXCL-1, -2, -3, -5, -6, -12) em CWF em comparação com NF (confirmado por ELISA). Funcionalmente, isto foi relacionado com a quimiotaxia de neutrófilos prejudicada em resposta ao meio condicionado por CWF. Embora a persistência de feridas que não cicatrizam seja, em parte, devida à inflamação crônica prolongada e à infecção bacteriana, as nossas investigações mostram que o envelhecimento prematuro dos fibroblastos e a incapacidade de expressar corretamente um código de endereço estromal também estão implicados na cronicidade da doença.


INTRODUÇÃO


O aumento da esperança de vida da população em geral nas últimas décadas levou a um crescente corpo de investigação sobre doenças degenerativas relacionadas com a idade que prejudicam enormemente a qualidade de vida dos indivíduos mais velhos. Doenças como o cancro, a doença de Alzheimer e a diabete substituem gradualmente as doenças cardíacas e as doenças respiratórias como as principais causas de problemas de saúde na população idosa. O declínio relacionado com a idade no potencial de reparação e regeneração da pele pode ser uma causa da não cicatrização de feridas, tais como úlceras venosas crônicas nas pernas, úlceras de pressão e úlceras diabéticas. Na verdade, foi relatado um aumento constante na sua incidência em indivíduos com mais de 65 anos (Margolis e col., 2002) e devido à sua frequência e consequente incapacidade, são agora considerados financeiramente a doença de pele mais importante em pacientes idosos.

Embora não exista uma teoria única e unificadora sobre a razão pela qual as feridas crónicas não cicatrizam, a inflamação crônica (Agren e col., 2000; Smith, 2001) e a infecção bacteriana (Robson, 1997; Dow e col., 1999) são dois fatores importantes que contribuem para a persistência da cronicidade da ferida. Esta cronicidade pode, por sua vez, levar ao envelhecimento celular/tecido localizado no local da ferida. Também está claro que dentro desse tecido envelhecido, a vasculatura fica comprometida (Montagna e Carlisle, 1979; West e col., 1996), a composição/renovação da matriz extracelular é desregulada (Lavker e col., 1987; Vitellaro-Zuccarello e col. , 1992; Watson e col., 1999; Chung e col., 2001; Isnard e col., 2002), e a função e as respostas dos fibroblastos são alteradas. No entanto, o papel do fibroblasto na inflamação crônica tem sido tipicamente ignorado. No entanto, os investigadores forneceram evidências recentes da existência de um código de endereço estromal (Parsonage e col., 2005) que fornece as pistas precisas necessárias para guiar os leucócitos infiltrantes até o local da lesão. Isto sugere que a incapacidade de resolver a inflamação em feridas crônicas é específica do tecido, como resultado da disfunção dos fibroblastos.

Foi relatado que tal disfunção de fibroblastos é devida a um aumento na proporção de células que sofrem parada irreversível do crescimento ou senescência replicativa (Dimri e col., 1995). Os fibroblastos senescentes, que ainda são metabolicamente ativos, são altamente estáveis e expressam numerosas enzimas e moléculas estruturais relacionadas à matriz extracelular, incluindo proteases, como metaloproteinases de matriz (MMPs; West e col., 1989; Millis e col., 1992; Wick e col., 1992; Wick e col., 1989; Millis e col., 1992; Wick e col., 1994), citocinas pró-inflamatórias (Kumar e col., 1993), transglutaminase tecidual (Kim e col., 2001), colágeno tipo III (Lovell e col., 1987; Vitellaro-Zuccarello e col., 1992), e fibronectina (Dumont e col., 2000), ao mesmo tempo que regula negativamente o principal componente estrutural da pele, o colágeno tipo I (Chung e col., 2001; Varani e col., 2004). A diminuição da proliferação e o aumento da senescência replicativa foram descritos para fibroblastos isolados do local da ferida crônica em comparação com fibroblastos normais da pele não ferida (Stanley e col., 1997; Loots e col., 1998; Vande Berg e col., 1998, 2005; Mendez e col., 1999; Stanley e Osler, 2001). No entanto, nem todos os estudos demonstraram isso e outros pesquisadores encontraram poucas evidências diretas de senescência replicativa em fibroblastos de feridas crônicas (CWFs) (Stephens e col., 2003). Portanto, apesar do nosso conhecimento de que o ambiente local e o estado inflamatório podem contribuir para o fenótipo de não cicatrização destas feridas, o papel do envelhecimento e da alteração do tempo de vida dos fibroblastos na ferida ainda não é totalmente compreendido.

A erosão gradual dos telômeros com sucessivas divisões celulares é um dos principais gatilhos intrínsecos da senescência replicativa em muitas populações de células somáticas e, portanto, tem o potencial de contribuir para o envelhecimento do organismo (Kipling e col., 1999; Kipling, 2001). Usando um método de alta resolução para medir o comprimento dos telômeros (Baird e col., 2003), é possível investigar o verdadeiro espectro dos comprimentos dos telômeros nas células. Tais descobertas podem então ser ligadas a respostas fenotípicas diferenciais observadas entre feridas crônicas e células normais correspondentes ao paciente (Herrick e col., 1996; Mendez e col., 1998; Agren e col., 1999; Stephens e col., 2003).

No entanto, o envelhecimento celular não é apenas um produto da erosão dos telômeros dependente da replicação. As células podem sofrer senescência prematura em resposta a uma variedade de estímulos externos, por exemplo, estresse oxidativo (Toussaint e col., 2000; Wlaschek e col., 2003; Naka e col., 2004). Feridas crônicas estão associadas a níveis elevados de estresse oxidativo (Wenk e col., 2001; Allhorn e col., 2003; James e col., 2003; Yeoh-Ellerton e Stacey, 2003; Wlaschek e Scharffetter-Kochanek, 2005) devido a No ambiente cronicamente inflamado, foi postulado que a senescência prematura induzida por estresse, em vez da 'verdadeira' senescência replicativa, é o principal fator que afeta o potencial de regeneração de fibroblastos em feridas que não cicatrizam (Wlaschek e Scharffetter-Kochanek, 2005). Além disso, foi relatado que tanto os queratinócitos como as células endoteliais isoladas de feridas crônicas têm uma incapacidade de regular positivamente as quimiocinas e citocinas necessárias para a resolução da inflamação crónica (Galkowska e col., 2006), o que pode ajudar a impulsionar a elevação contínua do stress oxidativo. 

Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do envelhecimento celular nas respostas dos fibroblastos em um contexto de ferida crônica. Utilizando feridas crônicas e fibroblastos normais (NFs) correspondentes ao paciente, esta investigação visa determinar os perfis de envelhecimento dessas células e como isso impacta nos padrões de expressão genômica e nas respostas funcionais dessas células em relação a um contexto de cicatrização de feridas.


RESULTADOS


CWF demonstra uma capacidade prejudicada de repovoar feridas experimentais in vitro em comparação com NF. Relatamos anteriormente os fenótipos distintos de CWF e NF em relação às suas capacidades de realizar atividades importantes de cicatrização de feridas (Cook e col., 2000; Stephens e col., 2003).

Este potencial disfuncional de cicatrização de feridas foi ainda corroborado usando um ensaio de ferida em monocamada e microscopia automatizada de lapso de tempo para avaliar a capacidade de CWF e NF de repovoar um espaço de ferida. A taxa de repovoamento de feridas por todas as amostras de CWF foi significativamente reduzida em comparação com a de NF correspondente ao paciente, particularmente às 24 horas (P <0,05).


CWF tem uma vida útil replicativa diminuída em comparação com NF


À luz dos relatos de que o ambiente da ferida crônica pode ter efeitos deletérios no potencial proliferativo de fibroblastos (Mendez e col., 1999; Seah e col., 2005), o tempo de vida replicativo do CWF e do NF correspondente ao paciente de quatro úlceras venosas crônicas de perna pacientes foram investigados. A análise da capacidade replicativa do CWF e do NF demonstrou que o CWF exibiu uma diminuição do tempo de vida proliferativa em comparação com o NF antes de se tornar senescente (P <0,05). Enquanto o NF de todos os quatro pacientes completou um número semelhante de duplicações populacionais (PDs) que se correlacionaram com o limite clássico de Hayflick descrito para tais células (Hayflick, 1965), o tempo de vida replicativo do CWF variou de 6 PD (paciente 3) a 40 PD. (paciente 4). A senescência foi ainda confirmada pela morfologia (células estreladas maiores com evidência de fibras de estresse interno;) e pela avaliação da atividade da b-galactosidase associada à senescência (SA b-Gal). Considerando que as populações de passagem precoce (quando CWF e NF estavam proliferando ativamente) de CWF e NF continham um número semelhante de células positivas para SA b-Gal, na passagem tardia (o ponto na cultura onde o CWF havia entrado em senescência, mas NF correspondentes ao paciente foram ainda em replicação), o CWF demonstrou atividade significativamente maior de SA b-Gal em comparação com NF ( P <0,05).

CWF exibe telômeros mais longos na senescência que NF



Como o CWF demonstrou um tempo de vida replicativo reduzido em comparação com o NF correspondente ao paciente, levantou-se a hipótese de que isto pode ser devido à erosão telomérica in vivo no ambiente da ferida crônica. A análise do comprimento dos telômeros únicos (STELA) foi utilizada para avaliar a dinâmica dos telômeros no nível de molécula única em populações de CWF e NF ao longo de sua vida replicativa. Notavelmente, particularmente na passagem inicial, as populações de células individuais exibiram uma ampla gama de comprimentos de telômeros (0,5 a 412 kb), indicativo do grande grau de heterogeneidade dentro de cada população. Telômeros ultracurtos distintos da distribuição principal também eram evidentes (pontas de seta). Além da heterogeneidade nas populações celulares, houve variação considerável na dinâmica dos telômeros das populações CWF e NF entre os pacientes no início da cultura. No paciente 1, não foram observadas diferenças significativas nos comprimentos médios dos telômeros entre CWF e NF na passagem precoce / PD, enquanto nos pacientes 2 e 3 os comprimentos médios dos telômeros do CWF foram maiores (P <0,05 e P <0,01, respectivamente).

No entanto, no paciente 4, os comprimentos médios dos telômeros foram menores no CWF (P <0,05). Quando as populações se tornaram senescentes (passagem tardia / PD), o STELA indicou claramente que em três em cada quatro indivíduos, os comprimentos médios dos telômeros do CWF eram significativamente maiores que os do NF (P <0, 01;). No quarto indivíduo, não foi aparente diferença significativa no comprimento médio dos telômeros (P40.1).


CWF exibe perfis alterados de expressão gênica tanto intrinsecamente quanto em resposta a um estímulo de ferimento artificial


Como diferenças distintas no estado proliferativo e na dinâmica dos telômeros eram evidentes para o CWF, uma análise global da expressão gênica foi realizada para determinar, no nível molecular, diferenças potenciais entre o CWF e o NF que poderiam ajudar a explicar esses achados. O modelo de privação/reestimulação de soro descrito por Iyer e col. (1999) foi usado em todas as quatro populações de CWF e NF de passagem precoce correspondentes a pacientes, com todas as células posteriormente analisadas utilizando microarranjos Affymetrix pré e pós-estimulação sérica.

Genes regulados diferencialmente entre CWF e NF independentes dos efeitos do soro foram inicialmente caracterizados.

Comum a todos os quatro pacientes, 118 genes foram regulados diferencialmente entre CWF e NF a uma taxa de descoberta falsa de 10%. Isto incluiu 53 genes que tiveram maior expressão no CWF e 65 genes que tiveram menor expressão no CWF. Dos 53 genes regulados positivamente no CWF, um subconjunto de genes foi classificável em uma das três categorias de interesse no que diz respeito à cicatrização de feridas, nomeadamente (i) envelhecimento celular/regulação do ciclo celular; (ii) relacionado ao estresse oxidativo; e (iii) relacionado ao citoesqueleto. Dos 65 genes que demonstraram menor expressão em CWF em comparação com NF, um subconjunto de genes foi classificado em uma das seis categorias de genes que pareceram interessantes em relação à cicatrização de feridas, nomeadamente (i) envelhecimento celular/ciclo celular regulamento; (ii) relacionada à resposta inflamatória; (iii) protease/inibidores de protease; (iv) sinalização do fator de crescimento; (v) componentes da matriz extracelular; e (vi) relacionado ao citoesqueleto.

O segundo método de análise caracterizou genes em que foram regulados diferencialmente entre CWF e NF em resposta ao soro. Com base em uma comparação dos níveis de expressão entre pacientes, um teste de diferença de diferenças identificou 28 genes que tiveram indução 42 vezes maior pelo soro no CWF do que no NF e 22 genes que tiveram indução 42 vezes menor pelo soro no CWF. Dos genes que foram menos induzidos no CWF, um subconjunto destes incluiu cinco membros diferentes da família de quimiocinas CXC e várias proteases, incluindo MMP1 e MMP12.


Da mesma forma, genes potencialmente relevantes dentro dos 28 genes que tiveram indução 42 vezes maior no CWF do que no NF incluíram 4 genes associados à atividade do fator de crescimento/citocina e hialuronano sintase 1.

Para corroborar estes resultados baseados apenas em alterações ao nível da expressão genética, três áreas de interesse foram investigadas com base nos seus perfis alterados de expressão genética entre CWF e NF e na importância potencial no ambiente da ferida crônica, nomeadamente (i) respostas ao stress oxidativo; (ii) produção de quimiocinas; e (iii) quimiotaxia dirigida de neutrófilos.


CWF demonstra níveis elevados de radical superóxido em comparação com NF


Como o perfil de microarray identificou a expressão alterada de genes de resposta ao estresse oxidativo dentro do CWF e como níveis elevados de estresse oxidativo são um fenômeno bem relatado em feridas crônicas (Wenk e col., 2001; Allhorn e col., 2003; James e col., 2003; James e col. , 2003; Yeoh-Ellerton e Stacey, 2003; Wlaschek e Scharffetter-Kochanek, 2005), o estado oxidativo de CWF e NF foi investigado utilizando o ensaio de redução do citocromo c para medir a geração de radicais superóxido ao longo de um período de 10 dias. Apesar de alguma heterogeneidade no nível de respostas entre os pacientes, a observação geral foi que ao longo do tempo do experimento, o NF demonstrou um declínio nos níveis de geração de radical superóxido, enquanto o CWF produziu níveis elevados.

Notavelmente, para todos os três pacientes investigados, o CWF produziu consistentemente níveis significativamente maiores de superóxido do que o NF durante os últimos momentos do ensaio (P <0,05).


CWF são deficientes na produção de CXCLs


A partir da análise da expressão gênica, foi observada a indução prejudicada de cinco membros diferentes da família de quimiocinas CXC (CXCL-1, -2, -3, -5 e -6) e diminuição da expressão independente de soro de um sexto (CXCL-12). em CWF em comparação com NF. A análise ELISA do CXCL-1, -5 e -12 foi, portanto, realizada para avaliar se tais alterações ao nível do gene eram espelhadas por alterações na sua produção ao nível da proteína. O meio condicionado pelas células foi avaliado 6 e 24 horas após a estimulação do soro. A produção de CXCL-1 demonstrou alguma heterogeneidade, com o CWF de dois dos três pacientes mostrando uma capacidade significativamente diminuída de produzir proteína CXCL-1 (em 6 e 24 horas) e o outro paciente produziu apenas níveis muito baixos da quimiocina (Po0,05 e Po0,01). Para CXCL-5, o CWF produziu consistentemente menos quimiocina em comparação com NF em todos os pacientes e em todos os momentos que alcançaram significância em todos, exceto no paciente 2 às 24 horas (P <0,01). Não houve evidência da produção de CXCL-12 por CWF ou NF quando avaliada por ELISA (dados não mostrados).


CWF demonstra uma capacidade retardada de estimular a quimiotaxia dirigida de leucócitos polimorfonucleares


Para relacionar os resultados do ELISA no que diz respeito aos níveis de quimiocinas no meio condicionado por CWF e NF com a atividade funcional, foram utilizadas câmaras de migração transwell para caracterizar os efeitos na quimiotaxia dos neutrófilos.

Utilizando meio colhido 6 horas após a estimulação do soro, o meio condicionado por NF de dois pacientes produziu uma resposta quimiotática positiva de neutrófilos, sustentada durante as 18 horas seguintes. Em contraste, o CWF demonstrou uma capacidade retardada para estimular a quimiotaxia dirigida dos neutrófilos, enquanto mostraram uma resposta fracamente positiva/ou ausência de resposta às 6 horas, que só se tornou fortemente positiva às 24 horas.


Discussão


Os fibroblastos dérmicos são reguladores chave das respostas de cicatrização de feridas na pele (Singer e Clark, 1999). No entanto, no caso das úlceras venosas da perna, a cicatrização é prejudicada e as evidências começam a apontar para o papel do fibroblasto na patogênese destas feridas crônicas que não cicatrizam. A atividade celular disfuncional do CWF relatada neste estudo está conforme o trabalho de outros (Herrick e col., 1996; Mendez e col., 1998; Agren e col., 1999; Cook e col., 2000; Stephens e col., 1999; Cook e col., 2000; Stephens e col. , 2003). Alguns estudos anteriores relataram que o CWF sofre senescência replicativa muito cedo na cultura, em comparação com fibroblastos dérmicos não envolvidos (Stanley e col., 1997; Mendez e col., 1998; Vande Berg e col., 1998), mas outros observaram crescimento sustentado por mais de 100 dias sem evidência de senescência (Stephens e col., 2003). No entanto, demonstramos que, embora a primeira opção seja verdadeira, o mecanismo de envelhecimento celular que causa a cura disfuncional pode não ser devido à simples erosão dos telômeros. Neste estudo, o CWF correspondente ao paciente e o NF não envolvido foram extensivamente cultivados até a senescência para caracterizar completamente o tempo de vida replicativo em CWF vs NF. Embora todas as amostras de CWF tivessem reduzido o tempo de vida replicativo, houve um grande grau de heterogeneidade entre os pacientes. Por exemplo, o CWF do paciente 3 refletiu as observações de Vande Berg e col. (1998), mas o CWF do paciente 4 proliferou por mais de 100 dias (semelhante a Stephens e col., 2003) antes da senescência. Isto foi claramente um reflexo dos ambientes heterogêneos das feridas dos quais as células derivaram, apesar das feridas terem um diagnóstico clínico semelhante. Em contraste, a NF de todos os pacientes foi submetida a um número semelhante de DPs num período semelhante.

Em seguida, analisamos o comprimento dos telômeros para determinar se o CWF era biologicamente mais envelhecido que o NF. O método padrão para medir telômeros, análise de fragmentos de restrição de telômeros, fornece apenas uma indicação grosseira do comprimento médio dos telômeros da população. Este estudo utilizou STELA, um método de alta resolução que mede com precisão os telômeros no nível unicelular (Baird e col., 2003). Isso permitiu que o amplo espectro de comprimentos de telômeros nas populações celulares fosse detectado. Como as populações de células derivadas de qualquer cultura primária são heterogêneas em relação ao comprimento dos telômeros (causado pela variação estocástica nas taxas de erosão dos telômeros) (Martin-Ruiz e col., 2004), STELA fornece informações mais detalhadas do que a análise de fragmentos de restrição de telômeros, incluindo 'outlier ' células com ultralongas ou ultracurtas

telômeros em relação à distribuição geral. Para células de passagem precoce, foi evidente uma clara heterogeneidade específica do paciente no comprimento dos telômeros, com os telômeros do CWF sendo mais longos que o NF em 2/4 pacientes, sendo o inverso evidente em um paciente e sem diferenças no quarto paciente. No entanto, na passagem tardia, o CWF apresentou telômeros mais longos do que o NF correspondente ao paciente em 3/4 pacientes, sem diferença no quarto paciente.Isto indica que as populações de CWF sofreram senescência antes de terem explorado a capacidade máxima de erosão dos telômeros que era evidente para NF compatível com pacientes.

Isto sugere que eventos simples de erosão telomérica devido a perdas de replicação final tiveram poucas consequências para o envelhecimento do CWF. Essas observações corroboram o argumento de que a erosão intrínseca dos telômeros causada por perdas de replicação final apenas estabelece um limite externo para a vida replicativa e que eventos estocásticos mais aleatórios causados por estresses extrínsecos poderiam ser a principal causa da senescência celular (Martin-Ruiz e col., 2004). ). Esses eventos estocásticos também poderiam ajudar a explicar o grande grau de heterogeneidade no comprimento dos telômeros evidente tanto para as populações de células de passagem precoce/PD quanto para as de passagem tardia/PD.

O estresse oxidativo é um fator extrínseco que afeta o envelhecimento celular. A resposta celular ao estresse oxidativo varia conforme o nível de exposição e enquanto o estresse leve causado pelo acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS) de baixo nível acelera a taxa de erosão dos telômeros (von Zglinicki e col., 2000; von Zglinicki, 2002; Kawanishi e Oikawa, 2004), altos níveis de estresse decorrentes do aumento da concentração de ERO induzem senescência prematura independente dos telômeros (Finkel, 1999; Wright e Shay, 2001, 2002; Song e col., 2005; Zhang, 2007). Como os locais de feridas crónicas apresentam níveis aumentados de stress oxidativo (Wenk e col., 2001; Allhorn e col., 2003; James e col., 2003; Wlaschek e Scharffetter-Kochanek, 2005), a senescência de “início precoce” na CWF relativa ao NF correspondente ao paciente pode ser uma consequência do aumento da exposição a ROS.

Esta hipótese foi apoiada pela análise de microarranjos de populações CWF vs NF, que demonstrou que vários genes associados a respostas ao estresse oxidativo sofreram aumento de expressão ou indução em CWF em comparação com populações de NF (GLRX, IL-11, FBXL5, ATP2C1). Posteriormente, a medição da produção de ERO utilizando o ensaio de redução de citocromo (Turner e col., 1998) revelou que enquanto o NF gerava níveis mais baixos de ERO ao longo do tempo, o CWF produzia níveis cada vez mais elevados de ERO. Isto está segundo os relatos de geração elevada de ERO por populações de células senescentes de fibroblastos (Lee e col., 2002; Chiba e col., 2005; Song e col., 2005; Zdanov e col., 2006; Passos e col., 2007; Probin e col., 2007). Portanto, supostamente altos níveis de estresse oxidativo no local da ferida (Wlaschek e Scharffetter-Kochanek, 2005) são provavelmente responsáveis pelo esgotamento da capacidade do CWF de resistir ao acúmulo de EROs.

Vários relatos implicaram a superprodução de EROs na patogênese da cicatrização crônica de feridas e da senescência/envelhecimento celular, apesar da presença de uma variedade de entidades antioxidantes celulares e extracelulares (Finkel e Holbrook, 2000; von Zglinicki, 2000; Sen, 2003; Wlaschek e Scharffetter-Kochanek, 2005). Na verdade, a superprodução de ROS pode inativar antioxidantes enzimáticos dérmicos (superóxido dismutases, catalase, peroxidações de glutationa e assim por diante) (Shukla e col., 1997; Steiling e col., 1999), esgotar os níveis de antioxidantes não enzimáticos (Shukla e col., 1997; James e col., 2001), e assim levar a danos no DNA, erosão dos telômeros, senescência celular (Finkel e Holbrook, 2000; von Zglinicki, 2000) e respostas celulares prejudicadas (Moseley e col., 2004).


Os dados aqui apresentados apoiam e ampliam esta hipótese, com apenas quatro genes com funções relacionadas ao estresse oxidativo/antioxidantes estabelecidas sendo reguladas positivamente no CWF, incluindo IL-11 (Waxman e col., 1998; Pascal e col., 2007), glutaredoxina (Berndt e col., 2007), ATPase transportadora de cálcio tipo 2C - membro 1 (Ramos-Castaneda e col., 2005) e F-box e proteína de repetição rica em leucina (Ho e col., 2006). Como os presentes dados implicam que existe uma falta de indução antioxidante enzimática importante no CWF, isto sugere que os mecanismos inatos de protecção contra o stress oxidativo são defeituosos. Estudos anteriores relataram uma indução antioxidante retardada em fibroblastos até que a senescência prematura seja totalmente atingida (Chen e col., 2004) ou a indução gravemente prejudicada de genes de defesa antioxidante em populações de fibroblastos senescentes (Kim e col., 2003), após estresse oxidativo. exposição. Conseqüentemente, esses achados explicariam o aumento da suscetibilidade do CWF ao estresse oxidativo e à senescência independente dos telômeros no ambiente da ferida crônica. É importante ressaltar que neste estudo, a expressão/atividade antioxidante enzimática alterada devido ao envelhecimento intrínseco nos tecidos dérmicos foi controlada pela comparação direta de CWF e NF correspondentes ao paciente. Curiosamente, a regulação positiva de genes no CWF, como a ATPase tipo 2C transportadora de cálcio - membro 1 e F-box e proteína de repetição rica em leucina, que estão associadas ao reconhecimento, degradação e remoção de proteínas malformadas através da proteína associada ao ER sistema de degradação após estresse de ER (Ramos-Castaneda e col., 2005; Ho e col., 2006; Yoshida, 2007), é de maior importância, dado que a senescência celular também está associada ao aumento do acúmulo de proteínas celulares oxidadas, devido a disfunções no componente proteossomo do sistema de degradação de proteínas associado ao RE, sob estresse oxidativo (Chondrogianni e Gonos, 2004; Torres e col., 2006).

Uma segunda categoria de genes com expressão aumentada em CWF vs NF incluiu componentes e reguladores do citoesqueleto (MAPRE1, MFAP5, ARPC5, ACTR3, KIAA0992, PTPRD, CAP1, PDLIM5, CDH2) que, em última análise, controla a adesão e migração celular (Knudsen e col., 1995 ; Welch e col., 1997; Freeman e Field, 2000; Parast e Otey, 2000; Boukhelifa e col., 2004; Kadrmas e Beckerle, 2004). A sua expressão aumentada no CWF correlaciona-se com um fenótipo de envelhecimento, uma vez que a ligação celular é aumentada em fibroblastos senescentes (Stephens e col., 2003). Esses achados também ajudam a explicar por que o repovoamento de feridas por CWF foi reduzido em comparação com o de NF. Como o repovoamento de feridas em cultura em monocamada depende de uma combinação de migração e proliferação, o fato de os CWF terem capacidade proliferativa reduzida (conforme relatado aqui e por outros) (Stanley e col., 1997; Mendez e col., 1998; Vande Berg e col., 1997; Mendez e col., 1998; Vande Berg e col.., 1998) impacta na taxa de repovoamento. No entanto, o principal mecanismo pelo qual o espaço vazio e desnudo da ferida é repovoado é pela migração de células na borda da ferida, e os dados aqui apresentados correlacionam-se com a diminuição das taxas de migração de fibroblastos de úlcera relatadas aqui e por outros (Raffetto e col., 2001).


Genes em que foram regulados diferencialmente em resposta à indução sérica (semelhante a uma resposta celular de cicatrização de feridas; Iyer e col., 1999) também foram caracterizados. Os genes com indução duas vezes menor em CWF vs NF incluíram cinco quimiocinas CXCL diferentes (CXCL-1, -2, -3, -5 e 6), que formam um agrupamento de genes co-regulados em 4q13.3 que também inclui IL -8. Todas essas cinco quimiocinas estão intimamente relacionadas e são funcionalmente semelhantes: todas elas se ligam ao CXCR2 (receptor de IL-8) na superfície dos neutrófilos, iniciando uma resposta inflamatória aguda após a lesão (Baggiolini, 2001). O CXCL-12 também foi constitutivamente menor no CWF, independente do soro. Assim, esta família de genes era potencialmente muito interessante em relação à cicatrização prejudicada de feridas. Portanto, nós os acompanhamos com mais detalhes, avaliando os níveis dos produtos secretados de três dos genes CXCL usando ELISA. Estes foram selecionados com base na sua função previamente relatada e na importância potencial na cicatrização de feridas. A proteína CXCL-12 não foi detectada em nenhum dos sobrenadantes da cultura, mas níveis reduzidos de CXCL-1 e CXCL-5 traduziram-se em reduções consistentes em produtos proteicos em CWF vs NF. Isto também foi funcionalmente significativo enquanto se correlacionou com a diminuição da quimiotaxia de neutrófilos de uma maneira específica do paciente que refletiu os níveis de quimiocinas de cada paciente. Isto confirma que a produção de CXCL-1 e CXCL-5 pelos fibroblastos é o principal indutor da quimiotaxia de neutrófilos (Lin e col., 2007).

A importância das quimiocinas CXC na mediação de respostas inflamatórias crônicas foi bem caracterizada usando a artrite reumatoide como modelo (Bradfield e col., 2003; Buckley, 2003; Burman e col., 2005), mas diferentemente da expressão prejudicada de quimiocinas que relatamos, fibroblastos sinoviais de pacientes com artrite reumatoide superexpressam essas quimiocinas.

Apesar da clara diferença entre a artrite reumatoide e as feridas crônicas que não cicatrizam, a conclusão predominante é que as quimiocinas CXC desempenham um papel crucial na resolução inflamatória. Nossas observações no CWF podem refletir a superexpressão crônica anterior de quimiocinas CXC no local da ferida, tornando as células exaustas após cultura in vitro. Alternativamente, o CWF pode não produzir os sinais corretos para criar uma resposta inflamatória aguda essencial para a cicatrização, bloqueando assim a ferida num estado perpétuo de inflamação crônica sem resolução. Tanto os queratinócitos quanto as células endoteliais de feridas crônicas têm uma capacidade prejudicada de regular positivamente citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias (Galkowska e col., 2006), e os pesquisadores postularam que a função prejudicada das quimiocinas derivadas de queratinócitos pode resultar em cicatrização retardada (Simka, 2007). No entanto, nossas descobertas de que os fibroblastos de feridas crônicas na pele têm perfis de expressão de quimiocinas defeituosos, até onde sabemos, não foram relatadas anteriormente.

A expressão de CD40 também foi menor no CWF e a ligação do fibroblasto CD40 induz citocinas pró-inflamatórias como IL-6 e IL-8 (Sempowski e col., 1997a, b, 1998). Por exemplo, os fibroblastos do endométrio, miométrio e colo do útero não apenas expressam CD40, mas também regulam positivamente a síntese do quimioatraente MCP-1 (CCL2), além de IL-6 e IL-8 após a ligação do CD40 (King e col., 2001 ). Isto apoia ainda mais a ideia de que o CWF não consegue promover e conduzir uma resposta inflamatória de fase aguda.

A indução prejudicada de ICAM1 pode, em combinação com a expressão prejudicada de quimiocinas, ter um impacto significativo na resolução inflamatória. Os pesquisadores descreveram evidências de que existe um código de endereço estromal, consistindo em três componentes: uma quimiocina, uma citocina e uma molécula de adesão celular, que atuam coletivamente como um farol molecular para a infiltração de leucócitos (Parsonage e col., 2005).

Um código de endereço vascular, expresso na superfície luminal do endotélio adjacente à lesão que recruta leucócitos circulantes, já foi descrito (Campbell e col., 2003), e o extravasamento de leucócitos através do endotélio vascular depende de eles expressarem um fenótipo complementar para este código. Atualmente, pouco se sabe sobre os mecanismos regulatórios que ocorrem além do endotélio vascular no próprio compartimento estromal, mas a ideia emergente de um código de endereço estromal necessário para guiar as células infiltrantes até o local da lesão está em desenvolvimento (Parsonage e col., 2005).

Em feridas crônicas, a cicatrização é comprometida por uma fase inflamatória prolongada e sem resolução, pela presença de populações bacterianas contaminantes e por altos níveis de estresse oxidativo. Neste estudo, foi confirmado que os CWF podem influenciar negativamente o processo de cicatrização, uma vez que eram biologicamente “mais velhos” do que os NF correspondentes ao paciente. Seu modo de envelhecimento não era dependente dos telômeros, mas era mais provavelmente uma consequência do alto estresse oxidativo sofrido no local da ferida. Dados de microarranjos e capacidade prejudicada de regular a formação de radicais superóxido indicaram isso. O CWF também expressou aberrantemente vários genes de matriz extracelular/protease/citoesquelético e não conseguiu repovoar feridas experimentais tão rápida e competentemente quanto o NF, indicando que a função prejudicada do CWF pode impactar na formação de tecido reparador in vivo. Além disso, este estudo mostra que o CWF tem uma capacidade prejudicada de produzir o código de endereço estromal correto necessário para recrutar as células inflamatórias necessárias para conduzir uma resposta inflamatória de fase aguda que poderia potencialmente superar a inflamação não resolvida de feridas crônicas. Mais pesquisas e manipulação deste código de endereço do estroma, juntamente com novas terapias antioxidantes, poderiam fornecer a chave para o sucesso do tratamento de feridas crônicas e outras doenças crônico-degenerativas no futuro.


MATERIAIS E MÉTODOS


Pacientes e tecidos


Culturas de CWFs e fibroblastos dérmicos não envolvidos (NF) correspondentes ao paciente foram obtidas com aprovação do Comitê de Ética Médica da Universidade de Cardiff e do Comitê Ético de Pesquisa Local e após consentimento informado por escrito de pacientes (n = 4) com úlceras venosas crônicas de perna que não cicatrizam frequentando a Clínica de Cura de Feridas do Hospital Universitário do País de Gales, Cardiff. Apenas pacientes com feridas que não responderam aos regimes de tratamento convencionais após 2 meses foram utilizados no estudo, e pacientes com diabete, imunossupressão sistêmica ou sinais clínicos de infecção local foram excluídos (para detalhes sobre a idade do paciente e duração da ferida) . Uma biópsia de 6 mm foi retirada do leito da ferida crônica e da face externa não envolvida da coxa ipsilateral. Todos os experimentos foram realizados segundo a Declaração dos Princípios de Helsinque.

Estabelecimento de feridas crônicas e NFs correspondentes ao paciente As culturas foram estabelecidas por uma técnica de suspensão unicelular após degradação enzimática das amostras, conforme descrito anteriormente (Stephens e col., 1996). Resumidamente, o tecido foi incubado durante a noite com dispase (2 mg ml; Sigma-Aldrich, Poole, UK) para separar o tecido epidérmico do tecido dérmico. O tecido do leito da ferida, embora sem epiderme, foi tratado de forma idêntica. Tecido dérmico

as amostras foram então desagregadas durante a noite utilizando colagenase bacteriana Clostridium histolyticum A (1mg ml1; Sigma-Aldrich).

As culturas de fibroblastos foram mantidas em meio contendo soro de fibroblastos contendo DMEM suplementado com L-glutamina (2mM), aminoácidos não essenciais, antibióticos (100Uml1 de penicilina G; 100mgml1 de sulfato de estreptomicina; 0,25mgml1 de anfotericina B) e 10%. (v/v) soro fetal de vitelo (todos os reagentes da Invitrogen, Paisley, Reino Unido). As culturas foram mantidas a 37 °C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2 (condições de cultura padrão). Na confluência, os fibroblastos foram tripsinizados com tripsina a 0,05% (p/v)/EDTA 0,53 mM (Sigma-Aldrich) e semeados novamente numa proporção de 1:3. Os PDs das populações celulares in vitro foram derivados por contagem direta do número de células nas passagens usando o método descrito anteriormente (Cristofalo e col., 1998). As populações de fibroblastos foram cultivadas até a senescência, conforme definido pela falta de crescimento e pela avaliação da morfologia e detecção da atividade SA b-Gal (Sigma-Aldrich). As células foram utilizadas para todos os ensaios funcionais em passagem baixa (P5–7) (equivalente a PD10–15). Como o CWF do paciente 3 envelheceu tão cedo na cultura (e, portanto, forneceu apenas números de células muito baixos), estudos funcionais (ferimento in vitro, geração de radical superóxido, ELISA CXCL e ensaios de quimiotaxia de neutrófilos) foram realizados usando apenas três das quatro amostras originais de pacientes.


Estudos de ferimentos in vitro


Um modelo padrão de ferida por arranhões em monocamada foi usado para caracterizar o repovoamento da ferida. As células foram semeadas em placas de cultura de tecidos de 24 poços (2104 células por poço), cultivadas até à confluência e as monocamadas foram feridas arranhando a superfície do plástico de cultura de tecidos com uma ponta de pipeta padrão de 200 ml. As monocamadas celulares foram suavemente lavadas com solução salina tamponada com fosfato, realimentadas com meio contendo soro de fibroblastos e incubadas sob condições de cultura padrão no estágio motorizado, aquecido e gaseificado de um microscópio Zeiss Axiovert 200M (Carl Zeiss, Welwyn Garden City , Reino Unido). As imagens foram coletadas a cada 15 minutos durante 40 horas utilizando o pacote de software Openlab, que também foi utilizado para análise pós-aquisição de imagens (Improvision, Coventry, Reino Unido).


Atividade da SA b-Gal


A avaliação da atividade SA b-Gal foi realizada conforme descrito anteriormente (Dimri e col., 1995). Resumidamente, os fibroblastos (5103 células por poço de uma lâmina de câmara de oito poços) foram cultivados como monocamadas durante 48 horas. As células foram fixadas em formaldeído a 4% (v/v) por 15 minutos e depois incubadas por 4 horas a 37 1C em solução SA b-Galstaining (1mgml1 5-bromo-4-cloro-3-indolil b-D-galactosidase (X-Gal ), ácido cítrico 40 mM (pH 6,0), fosfato de sódio 40 mM (pH 6,0), ferrocianeto de potássio 5 mM, ferricianeto de potássio 5 mM, cloreto de sódio 150 mM, cloreto de magnésio 2 mM; todos da Sigma-Aldrich). Os fibroblastos senescentes foram identificados como células coradas de azul por microscopia de luz padrão num microscópio invertido Olympus OM-10 e fotografados utilizando uma câmara digital Coolpix 995 (Nikon, Kingston upon Thames, Reino Unido).


ESTELA


O comprimento dos telômeros em populações de células de passagem precoce e de passagem tardia foi analisado usando os métodos de extração de DNA e PCR descritos anteriormente (Baird e col., 2003). Resumidamente, as células foram tripsinizadas, lavadas com solução salina tamponada com fosfato e o DNA genômico extraído pelos protocolos padrão de proteinase K, RNase A e fenol / clorofórmio (Sambrook e col., 1989). O DNA foi solubilizado por digestão com EcoRI (New England Biolabs, Hitchin, Reino Unido), quantificado por fluorometria Hoechst 33258 (Bio-Rad, Hemel Hempstead, Reino Unido) e diluído para 10 ng ml em Tris-HCl 10 mM (pH 7, 5). Uma reação de ligação foi então realizada a 35 °C por 12 horas em um volume de 10 ml contendo 10 ng de DNA genômico, ligante telorette 0,9 mM ((5'-TGCTCCGTGC ATCTGGCATCTAACCCT-30); MWG Biotech, Ebersberg, Alemanha) e 0,5 U de T4 DNA ligase (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) em tampão de ligação de 1 fabricante. O DNA ligado foi diluído para 250 pg.ml em água e múltiplas PCRs foram realizadas para cada DNA de teste em volumes de 10 ml contendo 100-250 pg de DNA ligado, 0,5 mM adjacente ao telômero (XpYpE2 (5'-TTGTCTCAGGGTCCTAGTG-30)) e primers teltail (5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATC-30) (MWG Biotech), Tris-HCl 75mM (pH 8,8), (NH4)2SO4 20mM, Tween 20 0,01% (todos Sigma-Aldrich), trifosfato de nucleotídeo 1,2mM (NTPs), 1,5mM MgCl2 (ambos Promega, Southampton, Reino Unido) e 1U de uma mistura 25:1 de Taq (ABgene, Epsom, Reino Unido) e polimerase Pwo (Roche Molecular Biochemicals, Welwyn Garden City, Reino Unido). A mistura de reação foi submetida às seguintes condições em um termociclador MJ PTC-225 (Fisher Scientific, Loughborough, Reino Unido): 25 ciclos de 94 1C por 15 segundos, 65 1C por 30 segundos e 68 1C por 10 minutos. Os fragmentos de DNA foram resolvidos por eletroforese em gel de agarose Tris-acetato-EDTA a 0,5% e detectados por hibridização Southern com uma sonda adjacente a telômeros marcada aleatoriamente com a-32P (GE Healthcare) gerada por PCR usando os primers XpYpE2 e XpYpB2 (50- TCTGAAAGTGG ACC (A / T) ATCAG-30) em DNA genômico digerido com EcoR1 e uma sonda para detectar o marcador de peso molecular de 1 kb (Stratagene, Amsterdã, Holanda). Fragmentos hibridizados foram detectados em um fosforImager Molecular Dynamics Typhoon 9200 (GE Healthcare). Os pesos moleculares das bandas de DNA foram calculados utilizando o ImageQuant TL (GE Healthcare). As comparações estatísticas foram feitas conforme indicado abaixo.


Análise de microarranjos Affymetrix


O RNA foi extraído de células induzidas por soro de todos os quatro pacientes seguindo o protocolo descrito por Iyer e col. (1999). Resumidamente, as células foram semeadas a uma densidade de 640 células cm2 em placas de 20 cm de diâmetro e cultivadas sob condições padrão durante 24 horas. As células foram então privadas de soro durante 48 horas para induzir a quiescência. As células foram então reestimuladas com soro e colhidas às 0 e 6 horas para extração de RNA. As células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato, incubadas com TRIzol (Invitrogen) à temperatura ambiente durante 10 minutos e o ARN foi extraído de acordo com protocolos padrão de extracção com fenol / clorofórmio (Sambrook e col., 1989). A concentração de RNA foi quantificada em uma máquina automatizada de quantificação de RNA (Bio-Rad) e a qualidade do RNA foi determinada usando o kit RNA Nano LabChip (Agilent Technologies, Wokingham, Reino Unido). As amostras foram então processadas pelo Serviço Central de Biotecnologia, Universidade de Cardiff, Cardiff, EUA, seguindo o protocolo detalhado para preparação de amostras e processamento de microarranjos disponível na Affymetrix (//www.affymetrix.com). Resumidamente, a primeira cadeia de ADNc foi sintetizada a partir de 5 mg de ARN total utilizando um iniciador T7- (dT) 24 (Genset Corp., Nottingham, Reino Unido) e transcrita reversamente com o kit de síntese de cDNA de cadeia dupla Superscript (Invitrogen). Após a síntese da segunda cadeia, o ADNc resultante foi submetido a uma reacção de transcrição in vitro utilizando um kit Bioarray (Enzo Diagnostics, Nova Iorque, NY) para gerar ARNc biotinilado. Este foi posteriormente fragmentado e hibridizado com o Affymetrix U133A GeneChip, que contém 22.000 conjuntos de sondas para detectar os transcritos de 14.000 genes humanos distintos, além de marcadores de sequências expressas adicionais. Após hibridização e digitalização, os arquivos de imagem resultantes (.CEL) foram analisados usando o algoritmo estatístico MAS 5.0 (Affymetrix) para calcular um valor de resumo de expressão para cada conjunto de sondas em cada GeneChip. Os dados de expressão resultantes foram dimensionados para uma intensidade alvo de 100. Os genes expressos diferencialmente foram identificados aplicando análise de variância aos valores de expressão para cada conjunto de sondas, utilizando o identificador do paciente, tipo de célula (CWF vs NF) e tratamento sérico (±) como os três conjuntos de fatores. Os valores P resultantes foram corrigidos para testes de hipóteses múltiplas usando o método de taxa de descoberta falsa (Benjamini e Hochberg, 1995). Os valores de expressão foram posteriormente visualizados e explorados por agrupamento hierárquico (semelhança de cosseno aplicada a dados centralizados na mediana e transformados em log) e visualização de mapa de calor.

O teste de diferença das diferenças foi realizado usando resumos de expressões gerados usando o algoritmo RMA (Irizarry e col., 2003). Para cada amostra de NF ou CWF do paciente, a alteração (log2) entre cada par de amostras com e sem soro foi calculada primeiro e depois foram calculados os valores médios para os grupos NF e CWF. Conjuntos de sondas foram selecionados onde a indução média (ou repressão) pelo soro foi duas vezes maior no grupo CWF quando comparado com o grupo NF.

Todas as análises foram realizadas em R (R DCT, 2006) e os scripts para todas as análises estão disponíveis aos autores mediante solicitação. Os valores de expressão e arquivos .CEL estarão disponíveis em Gene Expression Omnibus (Edgar e col., 2002).



Geração de radical superóxido


A geração de radical superóxido foi medida conforme descrito por Turner e col. (1998). As células foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 5104 células por poço (três poços contendo células e um poço livre de células por dia) em 1 ml de meio contendo soro de fibroblastos. Em vários momentos ao longo de 10 dias, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (3) e reincubadas com DMEM livre de vermelho de fenol e livre de soro contendo citocromo c 80 mM (coração de cavalo tipo III; Sigma-Aldrich) sob condições de cultura padrão por 2 horas.

O DMEM contendo citocromo c foi então removido de cada poço e a redução do citocromo c (uma função direta da geração de radical superóxido), medida a 550 nm em um espectrofotômetro UV/Visível Beckman DU 800 (Beckman Coulter, High Wycombe, Reino Unido), contra um branco consistindo em citocromo c-DMEM, derivado do poço livre de células. As células viáveis restantes foram tripsinizadas, contadas e utilizando um coeficiente de extinção molar de 21.000 mol cm1 l1, os dados foram expressos como nanomoles de geração de radical superóxido por 2 horas por 105 células.


Quantificação ELISA de proteína quimiocina


Kits ELISA (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido) foram utilizados para detectar níveis proteicos das quimiocinas CXCL-1, -5 e -12. Diluições em série dos padrões foram feitas e 200 ml do padrão, amostra ou controle foram adicionados por poço a uma placa de 96 poços fornecida com o kit. Os poços foram incubados durante 90 minutos à temperatura ambiente. Cada poço foi lavado com 400 ml de tampão de lavagem durante 1 minuto (3). Em seguida, foram adicionados 200 ml do conjugado CXCL apropriado a cada poço. Os poços foram então incubados durante 60 minutos a 4 1C. Após lavagem com tampão de lavagem (3), 200 ml da solução de substrato do fabricante foram adicionados a cada poço e incubados à temperatura ambiente por 15 minutos em ambiente escuro. Um volume de 50 ml de solução de parada do fabricante foi adicionado a cada poço e a densidade óptica de cada poço foi determinada espectrofotometricamente a 450 nm. A concentração de proteínas CXCL em cada amostra foi determinada a partir das curvas padrão.


Quimiotaxia de neutrófilos


A quimiotaxia foi monitorizada pela migração de neutrófilos humanos recentemente isolados, separados como descrito anteriormente (Laffafian e Hallett, 1995), através de insertos de filtro Corning Costar transwell (12 mm de diâmetro, 3, 0 mm de tamanho de poro; Sigma-Aldrich). O filtro transwell separou uma câmara superior, contendo 106 neutrófilos em 0,1 ml, da câmara inferior, formada pelos poços em placas de 12 poços. A câmara inferior continha o controle negativo, tampão de suspensão celular (DMEM); um controle positivo, f-met-leu-phe (1 mM; Sigma-Aldrich) em DMEM; ou meio condicionado por fibroblastos (600 ml). Após incubação (30 minutos, 37 °C, 5% de CO2), as células frouxamente ligadas à parte inferior do filtro foram desalojadas por batidas e as células na câmara inferior foram concentradas por centrifugação (1.000 g por 1 minuto) antes da ressuspensão e contagem. O número relativo de neutrófilos na câmara inferior foi pontuado semiquantitativamente.


Análises estatísticas


As análises estatísticas dos dados PDL e SA b-Gal foram realizadas usando o teste U de Mann-Whitney para dados não paramétricos e os dados STELA foram analisados usando um teste t de amostra independente. Os demais dados foram analisados pelo teste t não pareado de Student.



Leia o artigo completo através do: Journal of Investigative Dermatology (2008) 128, 2526–2540; doi:10.1038/jid.2008.114; published online 1 May 2008

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